- důležitá hlavně u mnohobuněčných organismů – z 1 buňky se diferencuje mnoho různých buněčných typů (např. buňky svalové, nervové, krevní,…) – příčinou diferenciace je akumulace různých druhů proteinů, a primárně tedy i RNA
- všechny zdravé somatické buňky obsahují shodné množství stejných genů a liší se tím, že tyto stejné geny různě využívají
- důkaz, že v každé buňce všechny geny – pokus: do vajíčka zbaveného jádra injikovat jádro ze somatické buňky → vznikne normální embryo (= základ klonování)
- housekeeping genes = geny nezbytné pro existenci organismu
- kódují housekeeping proteins
- za stabilních podmínek a na optimálním médiu asi 800 genů
- luxury genes = geny specifické pro diferencované buňky, které produkují proteiny zodpovědné za jejich specifické vlastnosti (např. hemoglobin v retikulocytech [= nezralé erytrocyty])
KONTROLA SYNTÉZY PROTEINŮ
- regulační body:
- genová doze – kolik identických genů má organismus pro 1 protein
- frekvence transkripce – kdy a jak často je gen přepisován – tato úroveň kontroly převažuje (buňka nesyntetizuje nepotřebné intermediáty)
- sestřih + další úpravy primárního transkriptu (= pre-mRNA = hnRNA, viz ***RNA)
- stabilita mRNA – pokud nestabilní, častá transkripce
- frekvence translace – výběr mRNA, která bude překládána
- regulace aktivity (stability) vzniklých proteinů
REGULACE INICIACE TRANSKRIPCE
- nejčastější regulace
- promotor = sekvence nukleotidů, na kterou nasedá RNA-polymeráza
- určuje směr transkripce
- iniciační místo (tam transkripce začíná) + sekvence cca 50 nukleotidů před (nutná pro navázání RNA-polymerázy)
- prokaryota – RNA-polymeráza potřebuje k rozpoznání promotoru sigma-faktor (syn. sigma podjednotka): pro každý typ promotoru jiný typ sigma-faktoru) – po transkripci asi 10 nukleotidů se sigma-faktor odváže a může být znovu využit, přičemž polymeráza pokračuje v transkripci dál
- regulační sekvence
- vážou se na ně regulační proteiny – každá regulační sekvence rozpoznávána jedním i více regulačními proteiny
- řídí zapínání a vypínání genu (zda gen exprimován závisí na typu buňky, okolí, stáří buňky atd.)
- délka: 10 nukleotidů (jen zapínají na podnět 1 signálu, hl. prokaryota) až 10000 nukleotidů (odpovídají na řadu signálů, hl. eukaryota)
- rozpoznání určité sekvence DNA regulačním proteinem: díky specifickému povrchu proteinu (DNA-vazebná doména, viz dále), kterým se pevně váže na určitý úsek DNA podle specifických rysů dvoušroubovice (dáno nukleotidovými sekvencemi); většina se váže do velkého žlábku
- interakce protein-DNA patří mezi nejpevnější a nejspecifičtější molekulové interakce – jednotlivé kontakty slabé, ale dohromady obvykle 20 kontaktů dostatečně specifické a pevné
- DNA-vazebné domény – stabilní konformační motivy, které se často opakují v interakci protein-DNA – nejtypičtější:
- homeodomain (homeodoména)
- tvořena 3 spojenými α-šroubovicemi
- zinc finger (zinkový prst)
- α-šroubovice + β-skládaný list – spolu spojeny atomem Zn
- obvykle kovalentně spojeno několik zinkových prstů
- leucine zipper (leucinový zip)
- spojené 2 α-šroubovice, které se jako dimery vážou na DNA a svírají ji mezi sebou
- winged-helix (forehead) proteins
- helix-loop-helix proteins – loop = smyčka
- DNA-vazebné proteiny se často připojují na DNA v párech (dimerech, viz leucinový zip) → zdvojnásobení plochy kontaktu s DNA → zvýšení pevnosti a specifity vazby – párovat mohou i různé druhy proteinů → značné množství sekvencí může být rozpoznáno malým počtem regulačních proteinů
důležité rozdíly iniciace transkripce u prokaryot a eukaryot
|
PROKARYOTA
|
EUKARYOTA
|
|
mají 1 RNA-polymerázu
|
mají 3 RNA-polymerázy
- RNA-pol. I a III → přepisují geny pro tRNA, rRNA, malé strukturní RNA
- RNA-pol. II → transkribuje geny kódující proteiny (= většina eukaryotických genů)
|
|
RNA-polymeráza schopna zahájit transkripci bez pomoci jiných proteinů
|
RNA-polymerázy vyžadují přítomnost dalších proteinů (= obecné transkripční faktory)
|
|
geny kontrolovány 1 regulační sekvencí, která se nachází blízko promotoru
|
regulační proteiny mohou ovlivňovat iniciaci i ze vzdálenosti několik tisíc nukleotidů od promotoru
+ regulace 1 promotoru mnoha regulačními sekvencemi rozptýlenými v DNA (před/za genem)
|
|
|
iniciace transkripce musí probíhat na DNA sbalené do nukleosomů a v mnohem kompaktnějším chromatinu → náročnější
|
REGULACE U PROKARYOT
- například bakterie Escherichia coli – genom tvořen cirkulární molekulou DNA – kóduje asi 4000 druhů proteinů, ale v každém okamžiku syntetizována jen malá část z nich (=> reguluje expresi mnoha svých genů dle nutričního zdroje v okolním prostředí (např. lac operon – laktóza, trp operon – tryptofan atd.)
-
- geny uspořádané stejným způsobem do 1 úseku a přepisované do 1 mRNA (ta je polycistronická = z 1 mRNA se translatuje více proteinů)
- operony existují jen u prokaryot (u eukaryot geny regulovány individuálně)
- všechny geny v operonu řízeny 1 promotorem
- součástí operátor = sekvence, na kterou se váže represor (regulační protein)
- často palindromy (invertované repetice) – centrálně symetrické → represory jsou dimery
- pokud se na represor naváže induktor, represor změní konformaci a:
- je schopen vázat se na operátor → to brání nasednout RNA-polymeráze → transkripce neprobíhá (= trp operon)
- není schopen vázat se na operátor → RNA-polymeráza může nasednout → transkripce probíhá (= lac operon)
- např. tryptofanový (trp) operon – pokud tryptofan přítomen v okolí bakterie → transportován do buňky → enzymy pro jeho syntézu nejsou potřeba → operon vypnut
- regulace tryptofanového operonu
-
- vysoká hladina tryptofanu v okolí buňky
- několik molekul tryptofanu (induktor) se naváže na tryptofanový represor → změna v jeho 3D struktuře → může se navázat na operátor (regulační sekvence 15 nukleotidů) → to fyzicky brání RNA-polymeráze nasednout na promotor → geny tryptofanového operonu se netranskribují (operon je vypnut)
- nízká hladina tryptofanu v okolí buňky
- tryptofanový represor neváže molekuly tryptofanu → nenasedne na operátor → RNA-polymeráza může rozpoznat promotor a nasednout → probíhá transkripce všech 5 genů tryptofanového operonu (operon je zapnut)
- represor spouští/zastavuje syntézu biosyntetických enzymů podle koncentrace konečného produktu dráhy, kterou dané enzymy katalyzují
-
- neregulovaná exprese genu
- gen, který kóduje represor je neustále s nízkou účinností přepisován → stálá nízká hladina v buňce → umožněna rychlá odpověď (např. na zvýšení koncentrace tryptofanu)
-
- proteiny, které navázáním na DNA zastavují transkripci genů
-
- proteiny, které navázáním na DNA navozují transkripci genů
- nutné u promotorů, které jen slabě vážou RNA-polymerázu → po navázání aktivátoru (napomáhá RNA-polymeráze iniciovat transkripci) již plně funkční
- např. aktivátorový protein CAP – naváže se na něj cAMP (cyklický adenosinmonofosfát) → CAP se naváže na DNA → RNA-polymeráza může začít transkripci
- cAMP signalizuje vyčerpání glukosy → syntéza enzymů, které umožňují využití jiných sacharidů z okolí
REGULACE U EUKARYOT
- RNA-polymeráza II není schopna sama začít transkripci – potřebuje obecné transkripční faktory
- napomáhají RNA-polymeráze nasednout na promotor, oddělit oba řetězce DNA a po iniciaci transkripce ji uvolnit z promotoru, aby mohlo začít prodlužování mRNA
- rozpoznávají všechny promotory přepisované RNA-polymerázou II (proto „obecné“)
- cis elementy = místa v DNA × trans elementy = proteiny, které se váží na cis elementy (tedy na DNA)
jak to celé funguje
- nejdůležitější – rozpoznání krátké sekvence DNA (asi 25 nukleotidů před iniciačním místem transkripce) = TATA box (hl. nukleotidy adenin a thymin) – obecným transkripčním faktorem TFIID
- TFIID (dvě velmi si podobné proteinové domény) způsobí dramatický lokální ohyb DNA → mohou nasednout ostatní transkripční faktory a RNA-polymeráza → vznikne transkripční iniciační komplex
- tento komplex brání RNA-polymeráze v prodlužování mRNA → RNA-polymeráza se musí z komplexu uvolnit → transkripční faktor TFIIH (kináza) s pomocí ATP fosforyluje RNA-polymerázu (připojí fosfáty na dlouhý polypeptid, který z ní vyčnívá) → změna její konformace → uvolnění z iniciačního komplexu → zahájena transkripce
- nakonec se z promotoru uvolní i transkripční faktory a jsou opět využity pro jinou iniciaci transkripce
eukaryotní regulační proteiny
- obecné transkripční faktory a RNA-polymeráza nestačí – nutné ještě další aktivační proteiny (pomáhají uspořádání obecných transkripčních faktorů a RNA-polymerázy do iniciačního komplexu)
- enhancery (zesilovače) = místa v DNA, na která se vážou aktivátory → rozvolnění chromozomů × silencery (zeslabovače) = místa v DNA, na která se vážou represory → spiralizace chromozomů
- aktivační proteiny mohou být navázány až tisíce nukleotidových párů daleko od promotoru a mohou ovlivňovat expresi genu nezávisle na tom, jestli jsou před/za genem
- DNA mezi enhancerem a promotorem stočena do smyčky → umožněn kontakt aktivátoru a RNA-polymerázy (nebo 1 z obecných transkripčních faktorů) na promotoru
- aktivátory usnadňují vznik transkripčního iniciačního komplexu × represory jeho vznik zpomalují/blokují
- eukaryotní regulační proteiny se vážou na sekvence, které jsou ekvivalentní k operátorům (represory) a aktivátor-vazebným sekvencím (aktivátory) u prokaryot
kombinační kontrola
- regulační proteiny nejsou funkčně samostatné jednotky → tvoří komplexy regulačních proteinů (pozitivní i negativní regulační proteiny)
- většina DNA mezi regulačními sekvencemi má pouze roli mezerníku (není rozpoznávána žádným regulačním proteinem) – různé ohyby, smyčky → i vzdálená místa mohou být ve skutečnosti velmi blízko
- regulační proteiny + poloha jimi rozpoznávaných regulačních sekvencí vzhledem k promotoru se liší gen od genu
- exprese různých genů může být řízena 1 regulačním proteinem
- pokud chybí protein potřebný striktně → transkripce neproběhne
- 1 regulační protein může mít rozhodující vliv na zapnutí/vypnutí konkrétního genu doplněním kombinace proteinů → pokud několik genů obsahuje sekvenci rozpoznávanou stejným regulačním proteinem, může ovlivnit všechny tyto geny
- např. glukokortikoidový receptor (= regulační protein) – pokud se na něj naváže glukokortikoidový hormon → tento receptor se může navázat na regulační oblast na DNA v několika genech
- jeden regulační protein může spustit tvorbu celého orgánu
- např. gen eyeless nezbytný pro vývoj oka v hlavové části u drosofily
- pokus: gen eyeless vložen do segmentu pro vývoj nohy → vzniklo oko na noze
|
